VU Magazine 1979 - pagina 346

yH magadne 36 jaar iemand op promoveerde nog nooit had gehoord. Daar werd duidelijk biologie bedreven. Maar de moleculaire biologie, hoewel misschien veel fundamenteler, had deze eerste dag meer weg van alchemie dan wat anders.

zo door totdat er evenveel bacteriën doodgaan als er door deling gevormd worden. Maar voordat die situatie ontstaat, is er een moment waarop er erg veel gezonde bacteriën zijn die zich allemaal willen vermenigvuldigen.

Nieuws

Gevoelig

Bij de koffie de volgende ochtend komt het nieuws ter sprake van de doorbraak bij Genentech, waar ze erin geslaagd zijn coli-bacteriën menselijk groeihormoon te laten produceren. Dat bewijst dat ondanks het vorig jaar ontdekte feit dat bacteriën DNA van hogere organismen niet zonder meer kunnen vertalen, het toch mogelijk is er zo aan te knutselen dat die barrières overwonnen worden. Iedereen is het er wel over eens dat die barrières, die nog niet waren ontdekt toen de discussie over de gevaren van recombinantDNA begon, de meeste van die gevaren volstrekt onwerkelijk maken. Natuurlijk, als iemand kwaad zou willen zijn er wel levensgevaarlijke scenario's te bedenken. Maar de natuur heeft al zoveel slimme levensgevaarlijke organismen bedacht dat het moeilijk zal zijn een betere te construeren. In ieder geval lijkt uit experimenten die zijn uitgevoerd in de laboratoria waar ook de verwekkers van de ongelooflijk gevaarlijke ziekten lassa- en Marburgkoorts bestudeerd worden, de conclusie te trekken dat het maken van een kankerverwekkende bacterie onmogelijk is. En dat was eigenlijk waar men in 1974 het allermeest bang voor was toen besloten werd bepaalde proeven met recombinant DNA op te schorten. Na de koffie worden eerst de bacteriën klaargemaakt waar de (misschien?) gevormde plasmiden weer in gestopt moeten worden. Van de hiervoor te gebruiken bacteriestam (ze staan in potjes klaar in de ijskast) wordt een kleine hoeveelheid in een reageerbuis gedaan met instant vleesextract. Die wordt in een soort au-bain-marie op 37° in beweging gehouden. Onder die omstandigheden gaat elke bacterie zich elke 20 minuten vermenigvuldigen. D.w.z. dat als je begint met 1000 bacteriën er na 60 min. 8000 zijn en na 2 uur 64000. En zoals iedereen weet die wel eens het verhaal heeft geprobeerd na te rekenen van de uitvinder van het schaakspel (op het eerste veld wilde hij 1 graankorrel, op het 2e twee, het 3e vier, enzovoorts) groeit het getal eerst langzaam aan, maar wordt dan snel astronomisch hoog. Dat gaat

Op dat moment zijn ze erg gevoelig voor invloeden van buitenaf. Zodra dus de mate van troebelheid van het eerst glasheldere vleesextract aangeeft dat de bacteriën in die fase van snelle toename zitten worden ze in de centrifuge gezet. De bacteriën zetten zich dan af op de bodem van de reageerbuis en blijven na het afgieten van het extract als een klef grauw plekje achter. Er wordt dan calciumcloride aan toegevoegd, een zout dat op een of andere wijze de celwand meer doorlaatbaar maakt. Om te kijken of de ligaties gelukt zijn, worden er vier reageerbuizen klaargemaakt met ieder 100 mu-liters bacteriën. Aan het eerste monster wordt geen DNA toegevoegd. Dat is om te controleren of er onder de gebruikte bacteriën niet toevallig mutaties zijn opgetreden die ze de eigenschappen verlenen waar we op gaan selecteren: resistentie tegen ampicilline en kanamycine, twee antibiotica. Aan het 2e monster wordt, ook ter controle, DNA toegevoegd van het in te korten plasmied. Aan het 3e monster wordt het DNA toegevoegd waar het ingekorte plasmied bij hoort te zitten, en aan het 4e monster tenslotte het mengsel waaruit een nieuw plasmied gemaakt zou moeten worden.

Uskast (-20 °C) waarin enzymen en plasmiden bewaard worden.

Schrikken Na de toevoeging van het DNA worden de bacteriën even aan het schrikken gemaakt door ze eerst een halfuur lang in ijs te zetten en dan drie minuten op 42° te brengen. Die plotselinge temperatuurswisselingen, terwijl hun celwand al verzwakt is, maakt dat het plasmied-DNA gemakkelijk de bacterie kan binnendringen. Na deze schokbehandeling worden ze weer in de watten gelegd. D.w.z. dat er weer extract wordt toegevoegd terwijl ook de temperatuur omhoog wordt gebracht. Controle Na twee uur groeien kunnen we dan door testkolonies uit te zetten op platen voedingsbodem, waaraan ampicilline of kanamycine is toegevoegd, gaan kijken of de gewenste plasmiden ook inderdaad gemaakt zijn. Hoe kunnen we dat nu doen? Het plasmied dat ingekort moet worden, kan door het restrictie-enzym Bam Hl in drie stukken geknipt worden. Twee van die knipplaatsen liggen aan weerszijden van het cloacine-gen dat we eruit willen hebben. De andere knipplaats ligt middenin het stukje DNA. het ,,gen", dat codeert voor resistentie tegen ampicilline. Door het knippen en weer ligeren zal een aantal producten ontstaan. Een deel vormt weer hetzelfde plasmied. Dat verraadt zich doordat het resistent is en cloacine vormt. Een ander gedeelte wordt uit dezelfde drie stukken gevormd, maar heeft hel cloacine-gen achterstevoren. Dan wordt het als nonsens gelezen. Het produceert dus geen cloacine. maar is van het gewenste plasmied te onderscheiden doordat het te zwaar is. en dus bij controle op een gel langzamer loopt. Dan wordt er ook een aantal producten gevormd van twee fragmenten, en datgene wat we willen hebben is dat fragment waarbij de twee delen van het amp-resistente gen weer netjes aan elkaar zitten. Bij het tweede experiment gaat het erom het gen voor Kan-resistentie toe te voegen aan een Amp-resistent plasmied. Het nieuwe plasmied moet dus tegen beide antibiotica resistent zijn, dat wil zeggen dat het zich moet kunnen vermenigvuldigen op een ondergrond waaraan die beide antibiotica zijn toegevoegd. Het overzetten van de bacteriën op de groeibodems is een eenvoudige zaak. Met een staafje worden druppeltjes bacteriekweek op de platen geprikt, zo dat er enige tientallen prikjes op iedere plaat zitten. Doordat bacteriën zich

Deze tekst is geautomatiseerd gemaakt en kan nog fouten bevatten. Digibron werkt voortdurend aan correctie. Klik voor het origineel door naar de pdf. Voor opmerkingen, vragen, informatie: contact.

Op Digibron -en alle daarin opgenomen content- is het databankrecht van toepassing. Gebruiksvoorwaarden. Data protection law applies to Digibron and the content of this database. Terms of use.

Printen